純化遺伝子組換え型ヒト造血因子に対するマウス骨髄単球性白血病細胞(ＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１)のclonal response

−無血清培養による検討−

 

梶ケ谷保彦, 他

 

Key words: WEHI-3B-Y1, differentiation, proliferation, recombinant human hemopoietic factor, serum-free culture

 

   The genes for the human hemopoietic factors have been cloned and recombinant material is available.  We tested purified recombinant human hemopoietic factors for their effects on the proliferation and differentiation of murine myelomonocytic leukemia cells (WEHI-3B-Y1) in serum-free agar culture.  We found that purified recombinant human G colony-stimulating factor (CSF) showed striking enhancement for the colony number of WEHI-3B-Y1 cells and differentiation-inducing activity with an increase in the number of colonies in the culture dish.  However, at low colony densities (<100/dish), G-CSF did not induce the differentiation of WEHI-3B-Y1 cells.  We conclude that G-CSF does not induce the differentiation of WEHI-3B-Y1 cells directly, but induce the differentiation as a result of the secondary autoinduction of differentiation. 

   Interleukin 3 (IL-3) showed slight enhancement and erythropoietin (Epo) did not showed alteration for the colony number of WEHI-3B-Y1 cells.  GM-CSF or M-CSF showed decrement for the colony number of WEHI-3B-Y1 cells.  Such purified recombinant human IL-3, Epo, GM-CSF and M-CSF did not induce morphologically the distinct differentiation of WEHI-3B-Y1 cells.

   At the time of the clinical usage of these recombinant form human hemopoietic factors in myelogeneous leukemia patient, we think that the response of patient's leukemic cells to these factors should be examined, using various in vitro assays. 

 

　　　　　　緒　　　　言

　最近では、遺伝子工学の進歩により種々の造血因子のcＤＮＡが単離され、さらに遺伝子組換え型の造血因子が大量に生産され純化されている。その臨床応用として白血病の化学療法後や骨髄移植後の顆粒球、血小板などの血球減少時に投与することが考えられている。しかしながら造血因子の白血病細胞の増殖（自己複製）および分化に及ぼす影響については未知の部分が多い。

　マウス骨髄単球性白血病細胞株ＷＥＨＩ-３Ｂはマウスおよびヒト顆粒球系コロニー刺激因子により分化が誘導されることが報告された1 2｡しかしながら最近、ＷＥＨＩ-３Ｂの培養細胞の少ない条件下では、顆粒球系コロニー刺激因子による分化誘導が観察されないことが報告され、これまでに報告されたＷＥＨＩ-３Ｂ細胞の顆粒球系コロニー刺激因子による分化誘導は、その直接作用ではないことが示唆されている3｡造血因子の単独作用や直接作用を厳密に検討するには、培養系に含まれる血清の影響を除外した無血清の培養系による検討が必要とされている。今回われわれは、無血清培養系を用いて、マウス骨髄単球性白血病細胞無血清・無蛋白培養株ＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ14に対する純化遺伝子組換え型ヒト造血因子の単独かつ直接作用について検討し、興味ある知見が得られたので報告する。

　　　　　　方　　　　法

　１．細胞とその培養

　無血清・無蛋白培養株であるＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞は4､血清、蛋白および脂質を含まない完全合成培地のHam's F-12培養液

（Flow Laboratory）にて２年以上継代されている細胞株で、培養液を３日毎に交換することによって継代維持された。培養は37℃、５％ＣＯ2を含む培養器の中で行われた。

　２．無血清軟寒天コロニー形成法

　われわれはすでに、無血清軟寒天培養条件下でＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞が集塊型コロニーを形成することを報告した4 5｡今回は､Fe

Cl3で鉄を飽和させた300μgの精製ヒトトランスフェリン(以下Tf,Sigma Chemical Co.)､１％ bovine serum albumin(以下ＢＳＡ,fraction ＊,Sigma)､ 0.3％ purified agar(Difco Lab.)を含むF-12培養液1.0mlにＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞を浮遊させ、35mm培養皿(Lux, 5217, grid)にseedingし、ゲル化ののち37℃、５％ＣＯ2の条件下にて培養した。

　３．mapping study による clonality の証明

　上記無血清培養条件下で一つの培養皿にＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞を30個浮遊させ、ゲル化ののち細胞の位置を倒立顕微鏡下にて

mappingし、７日目、14日目、21日目に形成された細胞集団の位置をmappingした。

　４．純化遺伝子組換え型ヒト造血因子

　遺伝子組換え型ヒト顆粒球系コロニー刺激因子（以下rhＧ-ＣＳＦ)(specific activity１×108 units/mg)2､遺伝子組換え型ヒト顆粒球・単球系コロニー刺激因子（以下rhＧＭ-ＣＳＦ)(specific activity １×108 units/mg)､遺伝子組換え型ヒトerythropoietin(以下rhＥpo)(specific activity >70,000 units/mg)6はKirin-AMGen Incorporationより供与された。またGenzyme Laboratoryの遺伝子組換え型ヒトinterleukin-３（以下rhＩＬ-３)(specific activity 1×108units/mg)､遺伝子組換え型ヒト単球系コロニー刺激因子（以下rhＭ-ＣＳＦ)(specific activity 1×108 units/mg)7を用いた。

　５．純化遺伝子組換え型ヒト造血因子がＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞のコロニー形成に及ぼす影響

　上記無血清培養条件下でＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞を浮遊させ、さらに純化遺伝子組換え型ヒト造血因子を添加し、14日間培養しコロニー形成を観察した。培養終了後倒立顕微鏡下にて40個以上の細胞集団をコロニーとして算定した。controlとしては造血因子無添加時のコロニー数を用いた。

　６．コロニー構成細胞の形態学的検討

　コロニー構成細胞の形態学的検討は、orcein染色およびesterase二重染色により行った。すなわち、軟寒天内コロニーをfine pipetteにてつりあげ、スライドグラス上にふきだしorcein染色した。又、Kubotaらの方法8に従い寒天ごと乾燥後、α-naphthyl butyrateおよびnaphthol ASD-chloroacetateによるesterase二重染色を行った。

 

　　　　　　結　　　　果

１．mapping study による clonalityの証明　　(Table 1)

　計300個のＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞をmapp-ingする検討を２回行った。７日目では、１回目および２回目のコロニー形成はそれぞれ、94個および98個であった。14日目および21日目のコロニー数もそれぞれ94個および98個でsubcolonyの形成は認められず、１個のＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞から１個のコロニーが形成されることが示された。

２．rhＧ-ＣＳＦに対するＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1細胞のclonal response

  14日目のコロニー数について検討した。rhＧ-ＣＳＦ添加により濃度依存性にＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1コロニー数の著明な増加傾向がみられ、1,000単位/ml添加時には約185％の増加が認められた(Fig. 1)。また、培養皿内のＷＥＨＩ-3B-Y1細胞を段階的に増加させ、さらにrhＧ-ＣＳＦ(1,000単位/ml)添加によりコロニー数を増加させるに従い、培養皿内のコロニー数が2,700個以上では、構成細胞のmigrationが誘導され拡散型コロニーの割合が約80％まで増加した(Table2, Fig. 2)。拡散型コロニーの構成細胞のorcein染色所見では、胞体の拡大、核・細胞質比の低下傾向、核の分葉傾向が認められた。しかしながら培養皿内にＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1細胞が100個の培養条件下では(Fig. 3)、21日目まで観察したが、rhＧ-ＣＳＦを100単位/mlから5,000単位/mlの濃度まで添加しても拡散型コロニーは観察されなかった。orcein染色所見でも構成細胞の分化傾向は認められなかった。

３．rhＩＬ-3，rhＧＭ-ＣＳＦ，rhＭ-ＣＳＦ，    rhＥpoに対するＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞    のclonal response (Fig. 4)

　いずれも14日目のコロニー数について検討した。rhＩＬ-３を添加することにより濃度依存性にＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１コロニー数の増加が認められた(危険率１％以下)。rhＧＭ-ＣＳＦまたはrhＭ-ＣＳＦを添加することにより濃度依存性にＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１コロニー数の減少傾向が認められた(危険率１％以下)。rhＥpoを50単位/mlまで添加してもＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１コロニー数の有意の変動は認められなかった。又、コロニー形態の倒立顕微鏡所見では、21日目まで観察したが、いずれの純化遺伝子組換え型ヒト造血因子を添加しても集塊型コロニーが形成され、そのorcein染色所見でも構成細胞の分化傾向は認められなかった。

４．コロニー構成細胞のesterase二重染色所見(Table 3)

　14日目のコロニー構成細胞のesterase二重染色所見では、rhＭ-ＣＳＦの添加によりbutyrate esterase陽性コロニーの割合の増加が認められた。rhＧ-ＣＳＦ,rhＩＬ-3,rhＧＭ-ＣＳＦ,rhＥpoいずれの添加においてもコロニー構成細胞の内訳に有意の変動は認められなかった。

　　　　　　考　　　　按

　マウス骨髄単球性白血病細胞株ＷＥＨＩ-３Ｂは鉱物油誘発骨髄単球性白血病のＢＡＬＢ/cマウスから樹立された細胞株で、軟寒天培養系においてコロニーを形成する9 10｡また、この細胞株では、培養皿内のコロニー数が増加するに従い、分化型コロニーの割合が増加する分化自己誘導現象が認められることも報告されている11｡われわれは先に、ＷＥＨＩ-３Ｂ培養上清の分析結果より、分子量約1.0万〜2.0万の分化自己誘導因子が産生されていることを示し12、さらにこの分化自己誘導因子は、ＩＬ-３、Ｇ-ＣＳＦ、tumor necrosis factor、leukemia inhibitory factorなどとは異なる液性因子であることを報告している13。

　一方、マウスの肺培養上清中にＷＥＨＩ-３Ｂ細胞を分化誘導する液性因子が存在することがMetcalfにより報告され分化誘導因子と造血因子の異同が問題となった14｡その後のNicollaによる精製分離の検討結果より分化誘導因子はマウスＧＭ-ＣＳＦとは分離されたがマウスＧ-ＣＳＦとは分離できず、最終的精製結果よりこの分化誘導因子はマウスＧ-ＣＳＦと同定された1｡

　最近では、遺伝子工学の進歩により種々の造血因子のcＤＮＡが単離され、さらに遺伝子組換え型のマウスおよびヒトの造血因子が大量に生産され純化されている。ヒトのＧ-ＣＳＦのアミノ酸配列はマウスＧ-ＣＳＦと73％の相同性があることが報告されており2 15､又、Souzaらによる血清を含む培養条件下での検討結果では、rhＧ-ＣＳＦによりＷＥＨＩ-３Ｂ細胞が分化を誘導されることが報告されている2｡

　しかし最近、B*hmerらによりＷＥＨＩ-３Ｂ細胞が少ない培養条件下では、マウスおよびヒトＧ-ＣＳＦによる分化誘導が観察されないことが報告され3､これまでのＧ-ＣＳＦによるＷＥＨＩ-３Ｂ細胞の分化誘導は、その直接作用ではないことが示唆されている3。　ＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1細胞は無血清・無蛋白の完全合成培地にて増殖可能なＷＥＨＩ-３Ｂ細胞の亜株で、血清および蛋白の影響を除外した研究に有用とされている4｡われわれは先に、このＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞が無血清軟寒天培養系においてコロニーを形成することを報告している4 5。今回のmapping studyでは、すべてのコロニーがsingle cell由来のcloneであることが示された。

　今回、われわれは血清の影響を除外し、造血因子単独の作用をみるために無血清軟寒天培養系による検討を行った。培養皿内のＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1細胞が100個の培養条件下では、rhＧ-ＣＳＦを5,000単位/mlの濃度まで添加しても分化型コロニーは観察されず、ＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1細胞の分化誘導は認められなかった。しかしながら、培養皿内のコロニー数が増加するに従い、分化型コロニーの増加が認められた。今回の検討結果より、遺伝子組換え型ヒトＧ-ＣＳＦによるＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1細胞の分化誘導は、その直接作用ではなく、Ｇ-ＣＳＦによるＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1由来コロニー数の増加に伴う二次的な分化自己誘導の結果であることが示された。また先のわれわれのＷＥＨＩ-３Ｂ細胞による分化自己誘導に関する検討結果12 13と今回の検討結果より、ヒトＧ-ＣＳＦによりＷＥＨＩ-３Ｂ細胞のclonal growthが刺激されコロニー数の増加をきたし、その結果、二次的に分化自己誘導因子産生が刺激されたものと考えられる。　今回のわれわれの無血清培養による検討では、rhＧ-ＣＳＦをはじめとしていずれの純化遺伝子組換え型ヒト造血因子の直接作用によるＷＥＨＩ-３Ｂ−Ｙ１細胞の明らかな形態学的な分化誘導は認められなかった。しかしながらrhＧＭ-ＣＳＦおよびrhＭ-ＣＳＦによりコロニー数の減少傾向が認められ、さらにrhＭ-ＣＳＦではbutyrate esterase陽性コロニーの割合の増加を認めたことより軽度の分化が誘導された結果とも考えられる。

　われわれは先に、ＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞がマウスＩＬ-3産生株であって、かつ遺伝子組換え型マウスＩＬ-3をＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞を含む無血清軟寒天培養系に添加することにより濃度依存性にコロニー数の増加を認め、マウスＩＬ-3によるＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞の増殖自己刺激を報告している5｡ヒトＩＬ-3はヒトの多能性造血前駆細胞の増殖・分化を刺激し16 17､他の造血因子と同様に化学療法後の臨床投与が期待されているが、最近では、骨髄性白血病患者の白血病細胞の増殖（自己複製）をrhＩＬ-3が刺激することが報告され、骨髄性白血病患者へのrhＩＬ-3の投与は慎重でなければならないことが示唆されている18 19｡マウスＩＬ-3とヒトＩＬ-3のアミノ酸配列には、29％の相同性があることが報告されており16､今回のわれわれの検討結果では、rhＩＬ-3により濃度依存性にＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１コロニーの増加傾向を認め、rhＩＬ-3によりＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞の増殖が刺激されることが示された。

　今回の検討結果およびこれまでの緒家の報告より、それぞれの遺伝子組換え型ヒト造血因子に対する個々の白血病細胞の反応（分化または自己複製）は異なること、又、培養条件によっても異なることが示された。従ってこれらの遺伝子組換え型ヒト造血因子の骨髄性白血病患者への臨床応用に関しては、in vitroでの個々の白血病細胞の反応を検討したうえでの臨床投与が望まれるものと思われる。また先のわれわれの検討結果5および今回の検討結果より無血清培養条件では、造血因子の単独かつ直接作用を検討できるだけでなく、細胞の造血因子に対する反応の感度が高いことも示され、血清を含む条件での検討で、有意差のある増殖刺激がみられない場合でも、無血清の条件下で明らかな増殖刺激が示される症例では造血因子の投与は慎重でなければならないと思われた。

 

　　　　　　総　　　　括

　純化遺伝子組換え型ヒト造血因子に対するＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞のclonal responseについて、無血清軟寒天培養系を用いて検討した。

　１．無血清培養による検討では、rhＧ-ＣＳＦ,rhＧＭ-ＣＳＦ,rhＭ-ＣＳＦ,rhＩＬ-3,rhＥpoのいずれも、その直接作用によるＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１細胞の明らかな形態学的分化誘導は認められなかった。rhＭ-ＣＳＦによりコロニー数の減少傾向と butyrate

esterase陽性コロニーの割合の増加を認め、軽度の分化が誘導された結果とも考えられた。

　２．rhＧ-ＣＳＦによるＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ1細胞の分化誘導は、その直接作用ではなく、二次的な分化自己誘導の結果であることが示された。

　３．純化遺伝子組換え型ヒト造血因子の白血病患者への臨床応用は、in vitroにおいてそれぞれの造血因子に対する個々の白血病細胞の反応（分化または自己複製）を、血清を含む培養系、無血清培養系など種々の条件で充分検討したうえでの臨床投与が望まれるものと思われた。

 

　謝辞：本研究の一部は昭和63年度財団法人がんの子供を守る会治療研究助成金の補助によった。

 

　　　　　文　　　　献

1)Nicola NA,Metcalf D,Matsumoto M,Johnson GR：Purification of a factor inducing differentiation in murine myelomonocytic leukemia cells：Identification as granulocyte colony-stimulating factor.J Biol Chem 258:9017-9023,1983.

2)Souza LM,Boone TC,Gabrilove J,Lai PH,Zsebo KM,Murdock DC,Chazin VR,Bruszewski J,Lu H,Chen KK,Barendt J,Platzer E,Moore MAS,Mertelsmann R,Welte K：Recombinant human granulocyte  colony-stimulating factor: Effect on normal and leukemic myeloid cells. Science 232:61-65,1986.

3)B*hmer RM,Burgess AW：Granulocytic colony-stimulating factor (G-CSF) dose not induce differentiation of WEHI-3B(D  +) cells but is required for the survival of the mature progeny. Int J Cancer 42:53-58,1988.

4)梶ケ谷保彦、生田孝一郎、佐々木秀樹、船曳哲典、小磯良孝、松山秀介：マウス骨髄単球性白血病細胞無蛋白培養株（ＷＥＨＩ-3B-Y1）の樹立とその性状．医学のあゆみ，142:51-52,1987.

5)梶ケ谷保彦、佐々木秀樹、生田孝一郎、松山秀介：マウス骨髄単球性白血病細胞(ＷＥＨＩ-３Ｂ-Ｙ１)による増殖自己刺激．日血会誌,51：1988 (in press)．

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7)Kawasaki ES,Ladner MB,Wang AM,Arsdell   JV,Warren MK,Coyne MY,Schweickart VL,Lee M,Wilson KJ,Boosman A,Stanley ER,Ralph P,Mark DF：Molecular cloning of a complementary DNA encoding human macrophage-specific colony-stimulating  factor (CSF-1). Science 230:291-296,1985.

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9)Warner NL,Moore MAS,Metcalf D：A transplantable myelomonocytic leukemia  in BALB/c mice:cytology,karyotype, and muramidase content.J Nat Cancer Inst 43:963-982,1969.

10)Metcalf D,Moore MAS,Warner NL：Colony formation in vitro by myelomonocytic leukemia cells. J Nat Cancer Inst 43:983-1001,1969.

11)Metcalf D,Nicola NA：Autoinduction of diffentiation in WEHI-3B leukemia cells. Int J Cancer 30:773-780,1982.

12)梶ケ谷保彦,生田孝一郎,佐々木秀樹,小磯良孝,船曳哲典,松山秀介：マウス骨髄単球性白血病細胞(ＷＥＨＩ-３Ｂ)による分化自己誘導．日血会誌 51:576-581,1988.

13)Kajigaya Y,Ikuta K,Sasaki H,Koiso Y,Funabuki T,Matsuyama S：The production of differentiation-autoinducing activity by WEHI-3B D+ leukemia cells. Exp Hematol (in press).

14)Metcalf D：Clonal analysis of the action of GM-CSF on the proliferation   and diffentiation of myelomonocytic leukemic cells. Int J Cancer 24:616-623,1979.

15)Tsuchiya M,Asano S,Kaziro Y,Nagata S：Isolation and characterization of cDNA for murine granulocyte colony-stimulating factor. Proc Natl Acad Sci  USA 83:7633-7637,1986.

16)Yang YC,Ciarietta AB,Temple PA,Chung MP,Kovacic S,Witek-Giannotti JS,Leary AC,Kriz R,Donahue RE,Wong GG,Clark SC :Human IL-3 (multi-CSF):Identification  by expression cloning of a novel hematopoietic growth factor related to murine IL-3. Cell 47:3-10,1986.

17)Otsuka T,Miyajima A,Brown N,Otsu K,Abrams J,Saeland S,Caux C,Malefijt RDW, Vries JD,Meyerson P,Yokota K,Gemmel L, Rennick D,Lee F,Arai N,Arai K,Yokota T：Isolation and characterization of an expressible cDNA encoding human IL-3:Induction of IL-3 mRNA in human T cell clones. J Immunol 140:2288-2295,1988.

18)Delwel R,Dorssers L,Touw I,Wagemaker G,L*wenberg B:Human recombinant multi-lineage colony stimulating factor (interleukin-3): Stimulator of acute myelocytic leukemia progenitor cells in vitro. Blood 70:333-336,1987.

19)Vellenga E,Ostapovicz D,O'Rourke B,Griffin JD：Effects of recombinant IL-3,GM-CSF, and G-CSF on proliferation of leukemic clonogenic cells in short-  term and long-term cultures. Leukemia 1:584-589,1987.